芦荟凝胶壳聚糖三元膜对大鼠深Ⅱ度烧伤的治疗作用
黄庆芳1，刘冰2*，冯承恩1
1.广东药学院医药化工学院，广东 广州 510006；2.广东药学院药科学院，广东 广州 510006
摘要：目的 制备芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜，研究其在大鼠皮肤深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中的作用。方法 制备芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜。取大鼠60只，随机分为模型对照组、湿润烧伤膏组、三元膜组，每组20只。造成深Ⅱ度烧伤模型后，测量大鼠烧伤后皮肤创面平均愈合时间及第1、3、7、14天创面愈合率，检测烧伤后第1、14天皮肤创面组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量、血清中肿瘤坏死因子（TNF-α）含量并作统计学分析。结果 与模型对照组相比，三元膜组能缩短烧伤大鼠皮肤创面愈合的时间（P<0.05），提高第3、7、14天的创面愈合率（P<0.01）。烧伤后第14天，与模型对照组相比，三元膜组皮肤创面组织中SOD含量升高（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01），血清中TNF-α含量降低（P<0.01）。以上指标，三元膜组和烧伤膏组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜可通过清除氧自由基、减少促炎症因子的生成，从而促进大鼠皮肤深Ⅱ度烧伤的愈合。
关键词：胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜；深Ⅱ度烧伤；氧自由基；促炎症因子
中图分类号：R644 文献标识码：A 文章编号：1009-9727(2016)07-0629-04
皮肤是人体大的器官，具有重要的物理、化学、生物学屏障功能，烧伤或创伤后引起的局部或全身损害都与皮肤屏障的丧失有关，早期结痂、封闭修复缺损皮肤、恢复其屏障功能成为烧伤治疗的根本目标。国内外不少研究者在研究能促进烧伤皮肤愈合的创面敷料，希望会获得高效、无刺激性的敷料。目前比较常见的敷料有胶原、壳聚糖、硫酸软骨素等，这些敷料各有其优缺点。本实验把以上材料经戊二醛-碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺复合改性，利用分子结构综合在一起，取长补短，并加入芦荟凝胶，以观察芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜在皮肤深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 壳聚糖（批号：F20110519），硫酸软骨素（CS，批号：DOO521201），-羟基琥珀酰亚胺（NHS，批号：Ky201105），1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC，批号：ALD27234），2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES，批号：HOO270801），甘氨酸(批号：yk201012)，均购自广州市齐云生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(批号：20140917)，微量丙二醛测试盒（批号：20140925）购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α 酶联免疫检测试剂盒（上海恒远生物科技有限公司，批号：20140925）；湿润烧伤膏（汕头市美宝制药有限公司，批号：130724）；库拉索芦荟凝胶（广东药学院医药化工学院提供，批号：20140716）。
1.2 仪器 紫外分光光度计（U-3900型，HITACHI）；1/10万天平（CP224D型，赛多利斯有限公司）；计算机图像分析仪（AST 486/PFG Image broad）；冷冻干燥仪（LGJ-10C型，天津四环电气控制设备有限公司）。
1.3 动物 SD 大鼠，60 只，雌雄兼用，SPF 级，体重180~220 g，由广东药学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2012-0125，饲养于屏障环境，饲养温度20~26 ℃，湿度40%~70%，喂颗粒标准饲料，自由进食和饮水，适应性喂养1周后开始实验。
1.4 实验方法
1.4.1 芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜的制备 胶原按文献[1]提取，与壳聚糖按1:1比例混合溶解于 0.5 mol/L 的冰醋酸，置于圆形模具中，加入0.25%戊二醛反应24 h，-20 ℃以下预冻4 h，于冷冻干燥仪内冻干成膜。将胶原膜依次置于 50 mmol/LMES、33 mmol/L EDC、25 mmol/L NHS 和含 1% CS 的40%乙醇溶液中浸泡。后将复合支架依次在0.1 mol/L Na2HPO4、1~2 mol/L NaCl、5~50 mmol/L甘氨酸、双蒸水反复清洗至中性，冻干成膜。每片膜上均匀喷涂0.5 mL芦荟凝胶，冻干得芦荟凝胶的胶原-壳聚糖-硫酸软骨素三元膜，每片3 g，冷藏备用。
1.4.2 大鼠分组及皮肤深Ⅱ度烧伤模型建立 SD大鼠60只，雌雄兼用，随机分为3 组，即模型对照组、烧伤膏组、三元膜组，每组20只。实验前1 d大鼠背部两侧皮肤剃毛，面积约为5 cm×5 cm。实验当日腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后固定，背部用自制操作板（中间有1.2 cm×1.2 cm正方形孔），取等重棉花固定于镊子中，沾上0.4 mL的酒精，点燃后，利用外焰直接燃烧皮肤，每只大鼠受热时间为5 s，形成深Ⅱ度烧伤创面（经病理组织切片证实深度到达真皮层；外观又红又白，有出血的水泡），立即腹腔内注射乳酸钠林格氏液5 mL一次以抗休克。各组每天给药1次，模型组涂抹无菌生理盐水，烧伤膏组和三元膜组给药后用无菌纱布和胶布加以固定，使药物和伤口接触至少4 h，期间大鼠戴自制项圈，防其舔舐伤口，连续给药14 d[2]。
1.4.3 愈合疗效评价 每日换药时肉眼观察创面，创面愈合过程中照相记录创面情况，通过计算机图像灰度积分系统分析创面愈合程度，同原始创面进行比对，计算愈合率及平均愈合天数。
1.4.4 大鼠创面组织中 SOD 活性、MDA 含量，血清中TNF-α表达水平的测定 大鼠形成深Ⅱ度烧伤模型后于第 1 天给药前、第 14 天给药后 4 h 每组取 10只，颈椎脱臼法处死动物，小心取创面组织块，用冰冷生理盐水漂洗除去皮下脂肪和其他结缔组织，冰浴条件下制成10%的组织匀浆，1 500 ×g离心15 min，取上清液。严格按照试剂盒说明书方法进行检测。组织中蛋白含量用考马斯亮蓝法，SOD活性用黄嘌呤氧化酶法，MDA用硫代巴比妥酸法，血清中TNF-α表达水平用ELISA法检测。
1.5 统计学分析 运用SPSS 17.0软件进行统计学分析，检测所得数据以x±s表示，各组间用单因素方差分析比较，P<0.05 为差异有统计意义。
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