大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达

　大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达

随着现代生物技术的发展, 基因治疗已成为继肿瘤的手术治疗和放疗、化疗后的又一新途径。特别是自杀基因治疗为目前国内外研究的热点之一。大肠杆菌DeoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能将无毒的前体药脱氧腺苷类似物分解产生剧毒的腺嘌呤类似物, 通过抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,而引起细胞死亡。同时它能够通过产生*的旁观者效应,不仅使转基因细胞被杀死,而且大量未转基因的细胞亦被杀死[1,2]。本文对大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）基因进行分子克隆并构建到pcDNA3.1真核表达载体中, 并获得稳定表达EPNP基因的MKN45细胞克隆,为今后进一步研究自杀基因在胃癌基因治疗中的应用创造条件。

　　1  材料和方法

　　1.1  载体与菌株  大肠杆菌JM109和真核表达载体pcDNA3.1均购自Invitrogen公司。克隆载体pMD18T购自大连宝生物公司。

　　1.2  主要试剂  限制性内切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA链接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均购自大连宝生物公司；凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geneticin（G418 Sulfate） 及MePdR为Invitrogen公司产品；IPTG和Xgal购自上海生物工程公司。实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。

　　1.3  目的基因的克隆  ①引物设计: 根据GenBank数据库提供的EPNP基因的核苷酸序列设计一对引物。为方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分别引入Hind III 和Bam HI 酶切位点。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：TATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大肠杆菌JM109基因组DNA的提取,按文献[3]方法进行。③PCR: 94℃变性5min进入循环,94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,经30个循环扩增后72℃延伸10min。取10μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。PCR产物的回收按PCR产物纯化Kit上的说明进行。回收产物保存于20℃备用。

　　1.4  PCR产物的克隆及测序  TA克隆载体pMD18T与胶回收纯化的PCR产物按1∶3（摩尔比）的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接, 16℃反应16ｈ。取10μｌ连接反应液转化JM109感受态细菌,将转化的菌液涂在Xgal 处理过的含有氨苄青霉素的LB平板上培养12ｈ,在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小提, 用酶切初步鉴定阳性细菌克隆, 将酶切鉴定正确的细菌克隆送交大连宝生物公司测序。

　　1.5  真核表达载体pcDNA3.1EPNP的构建和鉴定  测序正确的质粒pMD18T用限制酶Hind III和Bam HI进行双酶切反应, 纯化回收约716ｂp大小的目的片段; 质粒pcDNA3.1也进行Hind III和Bam HI双酶切,纯化回收大片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和线性化的空质粒pcDNA3.1, 16℃反应16ｈ。转化感受态细菌JM109,将转化的菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上培养12ｈ,挑取6个阳性克隆进行少量扩增、质粒小抽,以Hind III和BamHI双酶切鉴定阳性细菌克隆。

　　1.6  真核表达载体pcDNA3.1EPNP的转染  将重组质粒pcDNA3.1EPNP转化的感受态细菌JM109及以空载体pcDNA3.1转化的菌株,在LB培养基中于37℃培养18ｈ,按照质粒提取说明分别提取pcDNA3.1EPNP和pcDNA3.1,经紫外分光光度仪测定A260nm定量。按照LipofectaminTM Reagent脂质体转染说明转染胃癌细胞MKN45。

　　1.7  RTPCR 鉴定EPNP基因在MKN45细胞中的稳定表达  待具有Ｇ418抗性的MKN45细胞克隆长满6孔板时,抽提转染pcDNA3.1EPNP细胞（MKN45/pcDNA3.1EPNP）和转染空载体pcDNA3.1细胞（MKN45/pcDNA3.1）总RNA, 进行RTPCR反应, 鉴定EPNP和内参照GAPDH mRNA的表达。

　　1.8  MTT法检测MePdR对转染ECPNP细胞的细胞毒作用  转染pcDNA3.1EPNP细胞、转染空载体pcDNA3.1细胞和亲本细胞以1×104/孔接种于96孔板，24h后加入不同浓度的MePdR使终浓度分别为107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加药的未转染细胞作对照。每实验组设3个复孔，培养72h后加入MTT 20μl（5μg/ml）,4h后弃上清加入DMSO溶解，震荡10min后，酶标仪测490nm处吸光度（A）值，进而按下式计算各组细胞存活率：存活率=实验组A值/对照组A值×100%

　　2  结果

　　2.1  目的基因克隆及测序
   
　　以大肠杆菌基因组DNA为模板经PCR扩增出一条约716bp的特异条带,将纯化的PCR产物克隆于载体pMD18T中，转化JM109感受态细菌。蓝白筛选,随机挑取6个白色菌落提取质粒,用Hind III和BamHI双酶切后,释放出716bp左右的片段,见图1。测序结果经与Genbank中登录的序列相比较,序列*正确 （本文资料未列出），说明已成功扩增了大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的DNA序列。

　 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　M：DNA Marker （DL2000）; 1:pMD18T载体和EPNP基因; 2: PCR 产物

　　2.2  重组表达载体pcDNA3.1EPNP的构建和酶切鉴定
    重组质粒用限制酶Hind III和BamHI双酶切,电泳结果显示约716bp处有一特异条带,证明目的基因已正确插入质粒pcDNA3.1,得到了真核表达载体pcDNA3.1ECPNP，。

　重组质粒HindIII 和BamHI 双酶切鉴（略）

　　M：DNA Marker （DL2000）; 1:pcDNA3.1; 2: EPNP基因; 3: 重组质粒pcDNA3.1EPNP双酶切

　　2.3  RTPCR鉴定EPNP基因在MKN45细胞中的稳定表达
   
　　重组质粒pcDNA3.1EPNP转染后经Ｇ418（500μg/ml）筛选得到Ｇ418抗性细胞克隆,抽提细胞总RNA行逆转录反应, 采用特异性扩增EPNP基因的上、下游引物进行PCR反应,得到了EPNP基因的目的条带（716bp）,提示Ｇ418抗性细胞克隆中存在ECPNP基因。空质粒pcDNA3.1转染后获得的Ｇ418抗性细胞克隆经RTPCR后无特异性条带生成，。

　　图3  RTPCR 鉴定pcDNA3.1ECPNP转染细胞情况（略）

　　1: MKN45/pcDNA3.1;  2、3: MKN45/pcDNA3.1EPNP ; M: DNA Marker （DL2000）

　　2.4  MePdR对转染EPNP细胞的杀伤作用
   
　　用不同浓度的MePdR处理转染细胞和未转染细胞，MTT法检测细胞存活率。处理72h后，许多转染pcDNA3.1/EPNP细胞脱离了培养皿并且出现“收缩”现象，同时转染空载体pcDNA3.1细胞和未转染细胞仍然吸附在培养皿上未出现任何明显的细胞毒迹象，各种细胞存活率，见表4。很明显，MePdR并没有影响亲本细胞和转染空载体细胞的存活率，相反，MePdR对转染pcDNA3.1EPNP细胞有明显的细胞毒作用。

　　表4  不同终浓度的MePdR（0～105mol/L）（略）

　　3  结论
   
　　目前常用的自杀基因体系如:HSVTK体系和CD体系只能抑制DNA的复制,只能杀伤处于分裂期的肿瘤细胞,而在实体肿瘤中只有一部分肿瘤细胞处于分裂期,故对此类肿瘤,其杀伤力受到一定限制[4，5]。而经大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（EPNP）催化分解药物前体6甲基嘌呤脱氧核糖核苷（MePdR）产生的MeP不但可以抑制DNA的合成,而且可以抑制RNA和蛋白质的合成,从多个环节杀伤肿瘤细胞,不但可以杀伤处于分裂期的瘤细胞,而且可以杀伤静止的瘤细胞,具有强大的杀伤力。另外，MeP可以穿过脂质膜, 不需依赖细胞连接即可到达邻近细胞,将其杀伤,旁观者效应明显[6,7]。一个自杀基因体系的旁观者效应越强,其疗效就越好。HSVTK体系的毒性产物为磷酸化物。不能透过脂质膜,只能通过细胞连接进入紧邻细胞,故其旁观者效应必须依赖细胞连接[8]。
   
　　据elisa试剂盒报道：

本实验中构建的重组质粒限制性内切酶酶切图谱与预期结果相符,获得了约716bp大小的目的条带。目的基因测序结果与Genbank中登录的序列一致。因此,本实验中克隆的EPNP DNA序列是*正确的。我们在实验中采用特异性扩增EPNP基因的上、下游引物，通过RTPCT反应鉴定EPNP基因在转基因MKN45细胞中的表达,证实了具有Ｇ418抗性的转染重组质粒pcDNA3.1EPNP的MKN45细胞克隆中有EPNP基因的mRNA水平的表达;同时, 用MTT法检测前体药MePdR对EPNP高表达细胞的杀伤作用，发现前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。说明EPNP确实是药物敏感基因即自杀基因，也证明了这些细胞中有EPNP基因活性蛋白的表达。本实验中我们成功获得了稳定转染EPNP基因的MKN45细胞克隆, 为进一步研究PNP的生物学功能以及在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。