恒远详解杂交瘤的具体保存及复苏

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我们根据实验分析杂交瘤的保存

    当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。保存方法如下：

    1．材料

    (1) 细胞：取对数生长期的细胞。

    (2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。

    (3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

    (4) 灭菌的2ml安瓶等

    2．操作方法

    (1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。

    (2) 1 000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。

    (3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。

    (4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。

    (5) 放4℃ 2h。

    (6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。

    (7) 转入液氮部分。

    （二）复苏

    1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。

    2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。

    3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。

    4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。

    5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。

    6．继续培养，换液，以至形成单层。

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