细胞凋亡实验步骤

 

 细胞凋亡检测实验

 

细胞凋亡检测可以：

（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；

（2）应用于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗；

（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

实验方法原理

本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

 

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

实验步骤

一、试剂准备

 

1.  三尖杉酯碱（HT）：300μg/ml；

 

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

 

3.  EDTA缓冲液：5mol/L；

 

4.   碱性裂解液：0.2mol/L NaOH；

 

5.        醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；

注意事项

1.  诱导培养HL-60细胞时间要准确；

 

2.  荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。