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恒远生物| 免疫组化实验攻略

  • 发布日期:2025-07-02      浏览次数:114
    • 免疫组化(IHC)是一种利用抗体检测组织切片中蛋白质和其他抗原的技术,通过定位、定性和相对定量来研究这些抗原。以下是恒远生物为大家总结的免疫组化实验的完整攻略。

       
      一、实验原理
      免疫组化基于抗原抗体反应和化学显色原理。组织切片或细胞标本中的抗原先与一抗结合,然后通过二抗与一抗结合,最后通过显色系统(如DAB)或荧光系统使目标抗原可视化。
       
      二、实验前准备
      材料准备:组织切片、抗体、缓冲液等
      设备检查:确保切片机、孵育箱等设备正常工作
      工作台清洁:确保无细菌和异物污染
      实验计划:制定标准化操作流程,合理安排实验时间
       
      三、详细操作步骤
       
      1. 样本处理
      组织采集:手术或活检获取组织后,立即用10%中性福尔马林固定(6-48小时)
      脱水包埋:组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明后石蜡包埋
      切片制备:使用切片机制作4-5微米厚的切片,60°C烤片30-60分钟
       
      2. 脱蜡水化
      二甲苯溶液(Ⅰ)浸泡10分钟
      二甲苯溶液(Ⅱ)浸泡10分钟
      梯度酒精(100%、95%、80%、70%)各浸泡5分钟
      蒸馏水冲洗
       
      3. 抗原修复
      热修复:常用pH6.0柠檬酸盐缓冲液或pH9.0 Tris/EDTA缓冲液,95-100°C加热20分钟
      酶修复:使用胰蛋白酶或蛋白酶K处理
      冷冻切片可省去或减少抗原修复步骤
       
      4. 阻断内源性物质
      3%过氧化氢溶液处理10分钟,阻断内源性过氧化物酶
      正常血清(与二抗同源)封闭20分钟,减少非特异性结合
       
      5. 一抗孵育
      选择特异性高、亲和力强的一抗
      用PBS或TBS稀释一抗(常用比例1:100-1:500)
      滴加一抗覆盖组织,4°C过夜或室温1-2小时
      PBS洗涤3次,每次5分钟
       
      6. 二抗孵育
      选择与一抗种属匹配的二抗
      室温孵育30-60分钟
      PBS洗涤3次,每次5分钟
       
      7. 显色反应
      DAB显色:显微镜下控制反应时间(通常1-10分钟)
      荧光显色:避光操作,选择合适的荧光二抗
       
      8. 复染与封片
      苏木素复染细胞核1-2分钟
      梯度酒精脱水,二甲苯透明
      中性树脂封片或使用封片机
       
      四、关键注意事项
      样本质量:确保组织新鲜,固定及时充分
      抗体选择:验证抗体特异性,优化稀释比例
      抗原修复:根据抗原特性选择合适方法(pH值、时间)
      对照设置:必须设置阳性对照和阴性对照
      实验标准化:保持操作条件一致,避免批次差异
      试剂保存:抗体分装保存于-20°C,避免反复冻融
       
      五、常见问题解决
      背景染色高:增加封闭时间,优化抗体浓度,延长洗涤时间
      无信号:检查抗原修复方法,验证抗体有效性,延长孵育时间
      非特异性染色:更换封闭血清,调整一抗特异性
      组织脱落:使用防脱片玻片,优化烤片时间和温度
       
      通过严格遵循上述流程和注意事项,可以获得准确可靠的免疫组化结果。对于初学者,建议从标准化试剂盒开始,逐步掌握各项技术细节。上海恒远生物科技有限公司拥有自己的实验室,备有专业的技术研发团队,长期致力于各种生物试剂,细胞,血清,ELISA试剂盒的研发与销售,实验提供免费代测服务,并提供专业的技术服务,如果您有实验上的问题欢迎前来咨询,为您提供专业的一对一技术指导。