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恒远生物带大家认识HE染色的基本原理

  • 发布日期:2023-10-24      浏览次数:642
    • 上海恒远生物今天来给大家介绍一种细胞实验常用的染色方法,即苏木精—伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法。


      一、HE染色基本原理


      (1)细胞核染色原理


          苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。


      (2)细胞浆染色原理


          细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系,当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时,胞浆对外不显电性,此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时,大于蛋白质的等电点pH值,表现酸性电离,而带负电荷的阴离子,可被带正电荷的染料染色,现时胞核也被染色,核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下,在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子),就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织,嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。


      (3)细胞HE染色流程


          培养的细胞HE染色过程与组织切片的染色过程基本相同,包括样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明、封固和观察等步骤。


      1.样品制备


      细胞:取细胞密度约为1×105/mL接种于含盖玻片的培养瓶中,放入CO2培养箱中培养一段时间,待细胞基本长成单层,取出长有细胞的盖玻片,用PBS洗3次。


      2.染细胞核


      ①.固定


      1)将盖玻片浸入95%乙醇固定15min,PBS洗2次,每次1min;


      2)浸入苏木精染液,染色5-10min。


      ②.分色


      1)自来水浸洗,浸入稀盐酸乙醇溶液进行分色,数秒即可;


      2)自来水浸洗,浸入淡氨水中,使胞核蓝化3-5min;


      3)自来水浸洗。


      ③.染细胞质


      1)浸入伊红染液,染色5-10min;


      2)自来水浸洗;


      3.脱水


      逐级脱水:经70%、80%、90%乙醇各脱水1次,95%乙醇脱水2次,bai分百的乙醇脱水3次,每次1min。


      4.透明


      二甲苯透明3次,每次1min。


      5.封固


      在载玻片上滴加中性树胶,将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。


      6.观察


      光镜下观察,细胞质呈粉红色,细胞核呈蓝紫色。


      注意事项:


      ①.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长,组织酸化而影响细胞核着色。因此要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和tan酸锂水溶液中处理10-30min,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳,可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。


      ②.切片染苏木精后,分色这一步是关键,应在显微镜下控制进行,一般以细胞核染色清楚而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。


      ③.切片经酒精脱水后,入二甲苯时可出现白色不透明状态,此为脱水不che底,应将切片退回wu水酒精,换酒精、二甲苯,以求che脱水与透明。


      ④.在染色过程中不要让切片干燥,以免切片收缩、变形,影响神经元形态。


      ⑤.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前,切片周边均应擦干净或吸干多余水分。


      ⑥.zui后封固时,要用中性树脂,防止日后褪色,盖片要选大于组织块的面积,如漏出一部分不久将会褪色,所用树脂浓度要适当,树脂封固时不能有气泡。


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