细胞培养?咋培养?

    细胞培养，看似简单的一个实验，却不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自挂东南枝”。今天恒远生物就为大家盘整理出了一篇养细胞的注意事项，养细胞可不同于养闺女，稍微磕磕碰碰，一切就重新来过！希望广大科研汪能与细胞愉快的玩耍呦！

    （一）冷冻管应如何解冻 

    取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。

    （二）细胞冷冻管解冻培养时，DMSO如何处理

    在细胞解冻之后，可直接离心去除DMSO，用新鲜的培养基悬浮后直接放入含有 新鲜培养基的培养角瓶中进行细胞培养，如此可避免解冻后细胞生长受到DMSO影响。

    （三）可否使用与原先培养条件不同的培养基

    每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活，不应该马上替换。 

    （四）可否使用与原先培养条件不同的血清种类

    血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

    （五）何谓 FBS，FCS，CS，HS 

    FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，两者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 则是指小牛血清。HS （horseserum） 则是指马血清。 

    （六）培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2 

    一般培养基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO₃ 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO₂ 浓度。理论当培养基中 NaHCO₃ 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO₂；当培养基中 NaHCO₃ 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO₂ 培养细胞。 

    （七）何时须更换培养基。培养基中是否须添加抗生素。

    视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。 

    一般正常培养状态下，培养基中可以添加抗生素。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 μ/mL。 

    (八）贴壁细胞传代时所使用的trypsin-EDTA浓度及相应处理

    一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为0.25%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin的活性降低，并可减少污染的机会。

    （九）将一般动物细胞离心下来，离心速率多少

    回收动物细胞，其离心速率一般为1000 rpm，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。 

    （十）细胞的接种密度 

    依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

    （十一）细胞冷冻培养基的成分及DMSO的等级

    动物细胞冷冻保存时常使用的冷冻培养基是含 5-10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即为无菌状况，首次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中避光保存。

    （十二）冷冻保存细胞的方法及冷冻细胞浓度

    将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞直接离心收集，以含有DMSO*培养基或胎牛血清的冻存液重悬细胞至终浓度约1x106/ml。。以每管1～2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 

    冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

    （十三）如何避免细胞污染

    细胞污染的种类可分成细菌、真菌、霉菌、病毒等。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的方法。

    （十四）支原体 （mycoplasma）污染的细胞， 对细胞培养有何影响

    不能以肉眼观察出支原体污染异状。除极有经验的专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨。

    支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。

    （十五）培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏暗红色，且 pH 值会越来越偏碱性

    培养基保存于4 ℃冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 （通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2 ，以调整 pH 值。或酸碱调PH。

    （十六）L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

    L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

    （十七）什么培养基中可以省去加酚红？培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

    酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 

    丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 

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