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背景偏高,灵敏度偏低何解?

  • 发布日期:2019-08-29      浏览次数:1213
    •     ELISA实验中,常见的背景偏高,灵敏度偏低问题,造成的原因有很多,我司技术人员就此给大家总结归纳如下:

      背景偏高问题

      原因一:孔洗涤不充分
      解决方案:按照实验方案建议进行洗涤。

      原因二:洗涤缓冲液污染
      解决方案:制备新鲜的洗涤缓冲液。

      原因三:检测试剂过多
      解决方案:确保试剂被正确稀释或者减少检测试剂的推荐浓度。

      原因四:封闭缓冲液无效(例如检测试剂结合封闭剂;孔未*封闭)
      解决方案:尝试不同的封闭剂和/或将封闭剂添加到洗涤缓冲液。

      原因五:孵育/洗涤缓冲液的盐浓度
      解决方案:增加盐浓度可能会降低非特异性和/或减弱脱靶相互作用。

      原因六:读板前加入终止液后时间太长
      解决方案:添加终止液后立即读板。

      原因七:抗体出现非特异性结合
      解决方案:使用适当的封闭缓冲液,例如 BSA 或 5-10% 正常血清,如果是直标一抗,使用与一抗种属相同的血清,如果是非直标一抗,则使用与二抗种属相同的血清。确保孔已经过预处理,以防止非特异性附着。

      原因八:高抗体浓度
      解决方案:尝试不同的稀释度,以获得*结果。

      原因九:底物孵育在光下进行
      解决方案:底物孵育应避光进行,或根据试剂的实验方案建议进行。

      底物加入后孔中有沉淀生成
      解决方案:增大样品的稀释倍数或降低底物浓度。

      孔板脏
      解决方案:清洁孔板底部。

      灵敏度偏低问题

      原因一:ELISA试剂盒保存不当
      解决方案:按推荐方式保存所有试剂。请注意,各试剂的保存条件可能有所不同。

      原因二:靶标不足
      解决方案:浓缩样品或降低样品稀释度。

      原因三:检测试剂失活
      解决方案:确保报告酶/荧光素具有预期的活性。

      原因四:酶标仪设置不正确
      解决方案:在检测中,确保酶标仪设置为正确的吸收波长或激发/发射波长。

      原因五:测定方法不够灵敏
      解决方案:更换更灵敏的检测系统(例如从比色检测转变为化学发光/荧光检测)。更换更灵敏的测定方法(例如从直接 ELISA 方法转变为夹心 ELISA 方法)。延长孵育时间或升高温度。

      原因六:微量滴定板吸附靶标的效果不佳
      解决方案:将靶标共价结合到微量滴定板。

      原因七:底物不足
      解决方案:加入更多底物。

      原因八:样品类型不兼容(例如血清与细胞提取物)
      解决方案:对于没有验证过的样品种属,检测信号可能减弱或没有。使用验证过的样品类型作为阳性对照同时进行检测。

      原因九:缓冲液或样品成分干扰
      解决方案:确认试剂中是否存在干扰性化合物。例如,抗体中的(die)(dan)hua钠会抑制 HRP 酶,在血浆中用作抗凝剂的 EDTA 会抑制酶反应。

      原因十:混合或混用不同试剂盒的试剂
      解决方案:避免混合来自不同试剂盒的试剂。