结合物即酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中至关重要的关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良好的稳定性。
用于ELISA的酶应符合以下要求：
①纯度高
②催化反应的转化率高
③专一性强
④性质稳定
⑤来源丰富
⑥价格不贵
⑦制备成酶结合物后仍继续保存它的活性部分和催化能力
⑧在受检标本中不存在相同的酶
⑨相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等
在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm波优点有高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波优点有高吸收峰。HRP的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥7.0。
HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得留意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ外，更应留意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后天生产物量的测定进行试验。
国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000，酶作用的适合pH为8.0；用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000，适宜pH为9.6。在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空缺值也较低，但AP价格昂贵，制备结合物所得率也较HRP低。
制备结合物时所用抗体一般 均为纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab)2进行标记，则更可避免标本中RF的干扰。在ELISA中用酶标抗原的模式未几，总的要求是抗原必须是高纯度的。
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加进高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加进具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
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