新客户一：我用TMB显色15min后，加入2M硫酸100ul终止反应，然后读数。发现加入阳性血清的OD值不稳定，呈上涨的趋势，同时阴性和空白却稳定，这是什么原因呢？
上海恒远：这说明没有终止*，降低TMB的用量。一般情况下是不会涨太多的。
新客户二：我用夹心法ELISA测细胞因子, 检测标准抗原敏感性只能到 ng/ml水平,我应该从那些方面着手来提高敏感性呢?
上海恒远：如果单用双抗体夹心法测细胞因子，ELISA灵敏度能到1ng上下，这是方法学决定的。有三种方法可以提高灵敏度：一是用发光法或荧光法，有一种发光底物可直接替代TMB，效果明显；二是用生物素亲和素放大，三是用抗抗体法即包被抗体－细胞因子－单抗－抗鼠抗体接酶。zui后一种可以提高灵敏度到0.05ng。
新客户三：我看别人洗板时，用500ml瓶接输液器直接滴满，然后倒掉，洗板，会不会因为满了滴到其他孔，造成相互干扰。3％BSA不能高压，用蒸馏水稀释溶解后需要过滤吗？我的预实验先用方正棋盘法一次摸索一抗，二抗的浓度，而HRP-Avidin先用他的说明书：1：10000 或1：5000可以吗？再次预实验则固定一抗，二抗浓度，HRP-Aaidin浓度作一系列稀释，确定HRP-Aaidin浓度，对吗？阳性阴性值怎么确定？有的用S/P>=2.1,或大于阴性对照OD值的2.1倍，或阴性对照OD值+-2SD，到底那个对？我是双抗体夹心测抗原，无标准品。谢谢！
上海恒远：1）如果这样洗板的话，只要*次先把孔内液体甩去，再加洗涤液即可，不容易互相干扰的。zui后所有孔全部加满后，放置30-60秒再甩去，这样洗涤的更*。
2）BSA溶解后基本不用过滤，除非您的BSA质量不好。
3）没有标准品，那您有没有一些基本的标本，或者自己用纯化抗原稀释的质控品。您必须先对您的试剂定一个要求，比如说您希望将该抗原 1ng/ml测到0.2，那您就自制一个质控品，2ng/ml或5ng/ml都行，对应当OD就是0.4或1.0。阴性就用您被测的阴性血清。用质控品和阴性血清来摸索浓度，尽量把阳性质控品做高，阴性血清值做低。您摸浓度的过程基本可以，可以试试。
4）临界值的制定方法有很多，一般市面上定为大于阴性对照OD值的2.1倍的其实都是定值：0.105。因为如果阴性对照小于0.05的话按0.05计算。也有阴性对照加定值的（可以加0.1也可以加0.2），还有用阳性对照乘以定值的。这些都可以，关键看您的系统做阴性血清可以达到多少的值，和您的zui低灵敏度的值可以到多少。
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